利用BioNumerics分析新冠病毒
一、数据的准备
1.参考基因序列（NCBI下载的Genbank文件）
2.待分析的序列（新冠病毒基因组数据）
3.存储毒株相关信息的Excel文件
二、创建新的数据库
点击数据库创建图标创建一个新的数据库，并对其命名。
三、创建序列实验类型
创建数据库后进入到数据库主界面，点击实验类型创建图标
选择序列类型创建一个序列类型实验
对序列类型实验进行命名
点击完成后即创建好序列类型实验
同样的，按照上述方法根据CDS的名称依次创建序列类型实验
四、导入参考基因序列
点击数据库主界面左上角“文件”，选择“导入”
弹出的窗口中选择“序列类型数据”中的“从文本文件中导入EMBL /Genbank序列”
点击“浏览”选择参考基因序列文件
依次点击“下一步”
在导入模板窗口创建新的导入模板，注意此处实验类型应选择最初创建的序列实验genome
在导入规则窗口中选中源类型为“文件”一栏，然后点击编辑目标，和Key进行关联，再点击“是”，然后依次点击“下一步”、“完成”后对导入模板进行命名。
最后选择创建的导入模板依次点击“下一步”、“完成”后，参考序列即导入Bionumerics中
五、从参考序列中提取CDS序列
导入参考序列后，在数据库主界面的1号实验类型可以看到绿点，点击绿点则进入序列查看窗口
点击下方的CDS栏会选中CDS序列，右侧会显示对应CDS的名称
然后点击序列查看窗口左上角的“文件”，点击“保存选择”，在弹出的窗口中根据CDS的名称选择对应的实验。
按照上述方式，依次对其他CDS序列提取到相应的实验类型中
六、导入待分析的序列
和参考序列的导入类似，只是在导入时选择“序列类型数据”中的“从文本文件导入FASTA序列”。
此处支持序列文件的批量导入，后续的步骤和参考序列相同，都是创建新的导入模板，再按照模板导入序列文件。注意，此处的序列类型仍是选择“genome”
七、安装序列提取插件并设置
在数据库主界面点击左上角的“文件”，选择“安装/删除插件”，在弹出的窗口中的实用工具菜单选择“sequence extraction”插件并点击“Activate”进行激活
按照下图方式进入序列提取设置窗口
以“ORF1ab”为例，点击“添加”，按照下图进行选择
点击“下一步”后，点击“选择”，勾选参考序列条目后点击“是”
按照图中参数进行设置，点击“下一步”后，即设置完成，然后依次设置其他实验类型
八、提取样品序列的CDS序列
在数据库主界面下，勾选所有样品序列，点击“分析”菜单，按照如图步骤进行分析
等待分析一段时间即可在其他序列实验看到提取的数据
九、导入毒株信息
按照下图类似的Excel模板导入，CDS字段必需外，可扩展其他字段
点击数据导入图标，选择“条目信息数据”下的“导入字段（Excel文件）”，在导入模板界面，将key和key进行关联后，通过Shift键对其他字段进行全选，再点击“编辑目标”与“条目信息字段”进行关联
点击“是”后会弹出提示窗口，点击“是”即可
对导入模板命名后依次点击“下一步”、“完成”即可导入毒株信息
十、 在比对窗口进行序列比对
数据库主界面勾选所有样品序列后，点击右下方的比对，点击
创建比对，此时弹出命名的窗口
命名完后在弹出的窗口中选择CDS的序列实验，并点击“是”
比对窗口内可以通过如图方式切换不同实验的序列比对
选择实验名称后按照下图方式进行多重序列比对
按照默认参数设置
等待一段时间即出现序列的聚类图，根据结果按照MLST命名手动对相应的CDS进行编号
当同一编号的条目多时，可以勾选这些条目后回到数据库主界面，鼠标右键CDS名称的字段，批量进行命名，依次对所有序列实验比对并命名后即得到MLST结果
十一、导出MLST结果并导入Bionumerics分析
在数据库主界面按下图方式把结果保存至文件
此时会生成Excel表格，将结果按照如下模板整理并另存为Excel文件
导入MLST结果前需要创建字符类型实验，依次按照默认设置创建即可
点击数据导入图标，选择“特征字符数据”下的“导入字段和字符（Excel文件）”
导入模板界面首先将Key和key进行关联，而各CDS结果是与特征值“MLST”关联。
点击“是”后会弹出如下窗口，点击“是”即可
和其他数据导入类似，后续按照默认设置即可导入MLST结果
十二、MLST最小生成树构建
数据库主界面下勾选待分析的条目，创建对比
对比窗口点击MLST实验类型前的
图标，并点击
显示值图标即可看到MLST结果
此时鼠标右键字段中的采样地点进行分组
按照默认设置创建组后，条目即会以不同颜色进行分组
此时选择高级聚类分析
弹出的窗口中对聚类进行命名，并选择“分类数据的最小生成树”模板
点击“下一步”即生成MLST结果的最小生成树（Minimum Spanning Tree，MST），点击
图标将图自动缩放显示
点击显示设置图标可以更改设置显示出条目的Key
